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琼脂糖凝胶电泳实验中注意事项
发布时间:2021-07-21   点击次数:51次

实验原理
琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定 DNA、RNA 分子混合物,以琼脂凝胶作为支持物,利用 DNA 分子在电场中时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中由阴极向阳极运动。在一定的电场强度下,忽略DNA分子携带的电荷,DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与相对分子量成反比。


材料、试剂及器具
1、材料
合适的Marker(分子量标准);DNA 样品
2、试剂
加样缓冲液(6x或10x);琼脂糖;溴化乙锭(EB)。
3、器具
(1)电泳系统:电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。
(2)凝胶成像系统或紫外透射仪。


实验过程
1、按所分离的 DNA 分子的大小范围,选择合适的比例的凝胶,称取适量的琼脂粉,放到一锥形瓶中,加入适量的 TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至琼脂粉完全溶化,溶液透明。稍摇匀,得胶液。待胶液却至 60℃左右,在胶液内加入适量的比例的溴化乙锭液。
2、水平放置胶槽,在一端插好梳子,在槽内缓慢倒入已况至 60℃左右的胶液,使之形成均匀水平的胶面。
3、待胶凝固后,小心拔起梳子,使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。
4、在槽内加入TBE电泳缓冲液,至液面覆盖过胶面。
5、把待检样品,按合适比例与加样缓冲液混匀,用移液枪加至凝胶的加样孔中。
6、接通电泳仪和电泳槽,并接通电源,调节合适电压,稳压输出,开始电泳。
7、观察溴酚兰的带(蓝色)的位置。当其移动至约凝胶长2/3处时,可停止电泳。
8、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜,赶去气泡平铺,然后把凝胶放在上面。关上样品室外门,打开紫外灯(360nm 或 254nm),通过观察孔进行观察。


注意事项
1、电泳中使用的溴化乙锭(EB)为中度毒性、强致癌性物质,务必小心,勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门电泳区域操作,戴一次性手套,并及时更换。
2、预先加入EB 时可能使 DNA 的运动速度下降15%左右,且不同构型的 DNA 的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解,若凝胶放置一段时间后才观察,即使原来胶内或样品已加 EB,建议选择EB溶液浸泡染色。
3、加样进胶时不要形成气泡,需在凝胶液未凝固之前及时清除,否则,需重新制胶。
4、电泳时溴酚兰在琼脂糖凝胶中的运动速度可以用于参考电泳速度,已实际电泳条带运动速度为准。

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